Альтернативное лечение рака

Векторы в генотерапии рака: преимущество спор клостридий перед вирусами
24-09-2012

Солидные (твердые) опухоли составляют почти 90% всех онкологических заболеваний. Одним из потенциально перспективных способов лечения таких опухолей является генотерапия. Наиболее эффективные методики генотерапии основаны на доставке в пораженные клетки больного терапевтических генов с помощью вирусов, называемых вирусными векторами. К сожалению, такой способ лечения раковых опухолей обладает несколькими серьезными недостатками. Во-первых, для достижения значимого эффекта необходимо вводить их непосредственно внутрь опухоли, что значительно ограничивает область их применения, поскольку многие новообразования формируются и образуют метастазы в органах, недоступных для инъекционного введения вирусов. Во-вторых, злокачественные опухоли содержат как раковые клетки, так и здоровые, т.е. они характеризуются гетерогенностью, препятствующей вирусному инфицированию всех раковых клеток опухоли. В-третьих, полноценному функционированию и воспроизводству вирусов в зараженных клетках препятствует гипоксия (недостаток кислорода), свойственная большинству солидных опухолей. Вследствие этого часть раковых клеток опухоли остается неинфицированной терапевтическими вирусами, что приводит к ее возрождению.

Ранее было показано, что анаэробные бактерии способны селективно колонизировать твердые опухоли при их систематической доставке в опухоль. К таким бактериям относятся спорообразующие клостридии. Споры клостридий можно использовать как удобную систему доставки генетического материала в пораженные клетки, поскольку их легко получать и хранить; они устойчивы к внешним воздействиям и обладают онколитическим действием (способностью разрушать опухоли). Исследования, проведенные на животных и человеке, показали, что деградация опухоли почти во всех случаях происходит только внутри самой опухоли, не затрагивая той ее части, которая находится на границе со здоровыми тканями, хорошо снабжаемых кровью и кислородом. Споры клостридий, содержащие собственные противоопухолевые белковые факторы, можно дополнительно трансфецировать онколитическими генами. На моделях солидных опухолей животных было продемонстрировано, что комбинация трансгенных спор клостридий с традиционной химио- или лучевой терапией значительно повышает эффективность лечения.

Споры клостридий обладают значительным преимуществом перед вирусными векторами в терапии солидных опухолей. Однако, перед тем как использовать споры клостридий в клинической практике, необходимо убедиться в том, что они воздействуют исключительно на злокачественные новообразования, не затрагивая здоровых тканей, и способны уничтожать как первичные опухоли, так и метастазы. Современные технологии позволяют удовлетворить этим требованиям.

Введение

Генотерапия - лечение заболеваний человека с помощью введения специальных терапевтических генетических конструкций в пораженные клетки организма, - развивается в последнее время в ускоренном темпе и может оказаться эффективным методом лечения онкологических заболеваний (1). К концу 2006 года число клинически протестированных протоколов для генотерапии различных видов рака достигло 854, что составило 66,6 % от общего количества клинических испытаний различных заболеваний с помощью генотерапии (2). Это отражает тот факт, что онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в странах Запада (3).

Эффективность генотерапии определяется, прежде всего, системой доставки терапевтического генетического материала – так называемой векторной системой. Известные векторные системы принято подразделять на вирусные и невирусные. К настоящему времени именно вирусные векторы, обладающие онколитическим действием и способные к самовоспроизведению (репликационно-компетентные), зарекомендовали себя как наиболее перспективные инструменты генотерапии рака (4,5). Однако такая методика лечения злокачественных новообразований имеет ряд недостатков, связанных с необходимостью введения вирусов непосредственно внутрь опухоли, не всегда возможного из-за ее локализации или наличия метастазов. Большая часть известных вирусных векторов не обеспечивает инфицирования всех раковых клеток опухоли, что приводит к рецидивам (6). Несмотря на то, что многие вирусные векторы демонстрируют терапевтическое действие в тканях опухолей, изолированных у онкологических больных, пока не удалось получить достоверного подтверждения их клинической эффективности.

Солидные опухоли составляют 90% всех онкологических заболеваний. Все солидные опухоли объединяет общее свойство: по достижении ими 2 мм в диаметре, начинается ангиогенез – формирование новых кровеносных сосудов, питающих опухоль. Этот процесс индуцируется изменениями в микроокружении раковых клеток, такими как формирование неполноценных сосудов, появление участков гипоксии и возникновение гетерогенной популяции злокачественных клеток (7). Такое микроокружение благоприятно для роста анаэробных бактерий вида Clostridia. Клостридии - облигатные анаэробы, способные расти только при отсутствии кислорода в среде. Они обладают несколькими преимуществами перед другими бактериями, поскольку споры клостридий могут избирательно заселять участки твердых опухолей, подверженные гипоксии, прорастать в жизнеспособные клетки и размножаться, вызывая разрушение опухоли. Предварительные клинические испытания продемонстрировали безопасность для здоровья человека ряда непатогенных штаммов клостридий. Однако клостридии обладают одним недостатком в качестве способа лечения солидных опухолей. Как показали многочисленные эксперименты, практически во всех случаях онколизис прекращался на внешних границах опухолей, что объясняется неспособностью клостридий существовать в обогащенных кислородом участках опухолей, находящихся на границе со здоровыми тканями. По этой причине успешное лечение солидных опухолей с помощью клостридий возможно только в сочетании с другими методами, такими как химио- или радиочастотная терапия (8,9). Недавние эксперименты с непатогенными штаммами C. Novyi в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, включая винорельбин (vinorelbin) и доксетаксел (docetaxel), продемонстрировали высокую онколитическую активность. В настоящее время эта методика терапии проходит фазу I клинических испытаний (10).

Способность клостридий к селективной колонизации опухолей открывает широкие возможности для их использования в качестве векторов в генотерапии рака. Лечение солидных опухолей с помощью комбинации методов генотерапии спорами клостридий, несущих гены, которые кодируют белки с различным противораковым действием (11,12,13), и химио- или лучевой терапии дает лучшие результаты, чем терапия спорами клостридий без дополнительного генетического материала, вызывающего противораковый эффект (12).

Ниже представлен обзор известных вирусных систем, включающих вектора направленного действия, репликационно-дефектные (не способные к воспроизведению) вектора и репликационно-компетентные онколитические вирусы. Рассмотрены преимущества и недостатки их использования в генотерапии рака. Далее обсуждается разработка спор клостридий в качестве векторов для переноса терапевтического генетического материала, механизмы их действия, а также их преимущества и недостатки по сравнению с вирусными векторами.

Разработка и использование вирусных векторных систем для генотерапии рака

(А) Ретровирусные векторные системы

Одной из первых систем генотерапии стал ретровирусный вектор, сконструированный на основе вируса мышиного лейкоза Molonеy (MoMLV).

Ретровирусы – это РНК-содержащие вирусы, заражающие клетки путем слияния мембран вируса и клетки-мишени, с последующим образованием двунитевого ДНК-генома (провируса) по матрице вирусной РНК с помощью вирусного фермента - обратной транскриптазы. Формирование новых вирусных частиц происходит при усиленной наработке РНК-копий вирусного ДНК-генома в ядре клетки-хозяина и синтезе вирусных белков в цитоплазме клетки с последующим отпочковыванием готовых вирусных частиц, сопровождающимся гибелью клетки-хозяина.

Этот вектор обладает уникальной способностью инфицировать делящиеся клетки (14). ДНК-провирус MoMLV способен интегрироваться в геном делящихся клеток и передаваться по наследству вместе с клеточным геномом. Раковые клетки быстро растут и постоянно делятся, как, например, клетки глиомы - одной из наиболее распространенных опухолей мозга. Эксперименты по генотерапии модели глиомы на животных с помощью вектора на основе вируса MoMLV продемонстрировали низкую инфицируемость раковых клеток, что является распространенной проблемой в экспериментах in vivo. Вирусные векторы MoMLV оказались не способными охватывать весь объем опухоли (15). Для повышения эффективности этой вирусной системы разработали репликационно-компетентный вариант вирусного вектора MoMLV, способный к воспроизводству в инфицированных клетках (16). Однократное внутричерепное введение репликационно-компетентного варианта вирусного вектора MoMLV в ксенографты глиомы человека у мышей приводило к распространению этого вируса далеко за пределы места инъекции, затрагивая только раковые клетки: в здоровых тканях мышей вирусы не обнаружились (16).

В целом, клинические испытания с помощью векторных систем на основе вируса MoMLV составляют более 23% от клинических испытаний всех систем генотерапии различных заболеваний человека. Эксперименты на мышах не выявили значимого токсического эффекта, вызываемого этими вирусами. Несмотря на это, ретровирусные системы представляют потенциальную опасность для здоровья человека, поскольку способны активировать онкогены и блокировать опухолевые супрессорные гены в инфицированных клетках. К сожалению, онкогенный эффект ретровируса был подтвержден клинически: после инфицирования терапевтическим вектором MoMLV стволовых клеток костного мозга детей, страдающих тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (Severe Combine Immunodeficiency Disease - SCID) – тяжелым заболеванием, часто приводящим у гибели детей грудного и младшего возраста, у 4 из 11 детей развилась лейкемия (17). Для внедрения этих векторов в клиническую практику требуется провести дополнительные исследования, направленные на повышение их безопасности и на улучшение инфицирующей способности вирусов, необходимой для уничтожения максимального количества раковых клеток в солидных опухолях

http://www.eurolab.ua/encyclopedia/565/6198/

_________________
с возврашением я рад всем

Лентивирусы относятся к ретровирусам и характеризуются более длительным инкубационным периодом. Терапевтическим преимуществом векторов на основе лентивирусов, по сравнению с ретровирусными векторами, является их способность переносить длинные фрагменты генетической информации в геном инфицируемой клетки. Эти вектора основаны преимущественно на вирусах иммунодефицита человека (ВИЧ) и быка, и обладают всеми уникальными характеристиками вирусного вектора MoMLV, а также способностью переносить гены в постмитотические клетки in vitro и in vivo (18). Несмотря на подтверждение эффективного переноса генов в раковые клетки на моделях солидных опухолей с помощью векторов на основе ВИЧ, терапевтическое использование этих векторов вызывает опасения, поскольку ВИЧ является серьезным патогеном человека. Однако в настоящее время проводятся клинические испытания лентивирусных векторов, направленные на оценку безопасности их применения в терапии СПИДа (19). Более безопасными считаются вектора на основе лентивирусов быка. Одним из примеров таких векторов служит безопасный для человека вирус болезни Йембрана JDV (Jembrana Disease Virus), поражающий определенные виды крупного рогатого скота в округе Йембрана на острове Бали в Индонезии (20, 21). Вирус JDV обладает теми же преимуществами в качестве вектора, что и ВИЧ: он способен интенсивно размножаться и интегрироваться в хромосомы не пролиферирующих клеток.

(Б) Аденовирусные векторы

Одной из наиболее хорошо изученных и широко используемых систем доставки терапевтических генов в раковые клетки человека являются вектора на основе аденовирусов (АВ, adenoviral vector - AV). Они особенно полезны в тех случаях, когда необходима лишь временная продукция терапевтического гена. Аденовирусы способны к воспроизводству в больших количествах и характеризуются эффективным переносом генов в различные типы раковых клеток (22). Два варианта векторов на основе аденовирусов были одобрены в Китае для клинического применения (23).

Кроме этого, несколько векторов на основе собачьих, свиных, овечьих, бычьих и птичьих аденовирусов было разработано для генотерапии раков человека. Один из таких векторов продемонстрировал терапевтическую эффективность на модели рака простаты у животных (24).

Основной проблемой, возникающей при разработке аденовирусных векторов для терапии рака, является недостаточная инфицирующая способность вирусов. В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на повышение прицельности и терапевтической эффективности рекомбинантных аденовирусных векторов (25).

(В) Векторы на основе адено-ассоциированных вирусов

Вектора на основе адено-ассоциированных вирусов (ААВ, аdeno-associated virus - AAV) не вызывают токсического эффекта и проявляют высокую инфицирующую способность, как показывают доклинические испытания нескольких таких вирусов (26). На моделях глиомы у грызунов было продемонстрировано, что ААВ, кодирующий рецептор фактора роста сосудого эндотелия VEGF (vascular endothelial growth factor), способен блокировать рост опухолей. Несмотря на высокую эффективность ААВ, технология их получения и очитки представляет собой достаточно сложный и дорогостоящий процесс (27).

(Г) Векторы на основе вирусов герпеса

Благодаря высокой эффективности и не сложной методике получения, векторы на основе вирусов герпеса пользуются особенной популярностью среди разработчиков векторных систем. В настоящее время со многими вариантами терапевтических векторов на основе вирусов герпеса проводятся клинические испытания. Как в случае векторов на основе других вирусов, терапевтический интерес представляют только репликационно-компетентные штаммы вирусов герпеса. Первый вектор такого рода был создан на основе мутантного вируса герпеса с дефектным геном r34.5, отвечающим за нейротоксичность вируса. Инактивация гена r34.5 ограничила способность вируса к размножению в клетках центральной нервной системы и блокировала возможность его существования в латентной форме. Однако позже обнаружилось, что отсутствие активности гена r34.5 значительно снизило способность мутантного вируса к воспроизводству в раковых клетках (28).

Терапевтические возможности векторов на основе вирусов герпеса могут существенно ограничиваться наличием к нему иммунитета у пациентов. Иммунный ответ организма предотвращает перенос вирусами терапевтических генов к периферическим органам и вызывает гепатотоксичность. Однако некоторые мутантные штаммы вирусов герпеса продемонстрировали успешное лечение рака печени в модели на мышах, обусловленное, как предполагают ученые, непосредственным вирусным онколизисом и активностью специфических эффекторных клеток иммунной системы (29).

(Д) Вирусные векторы направленного действия

Основной проблемой, связанной с генотерапией вирусными векторами, остается низкая эффективность адресной доставки генов в раковые клетки. На пути к клетке-мишени вирус сталкивается с физическим препятствием – эндотелиальной стенкой сосудов. В качестве одного из способов решения этой проблемы был разработан аденовирусный вектор, нацеленный на рецепторный механизм трансцитоза (прохождения сквозь клетки эндотелиалия) с помощью специальных адаптерных молекул (32). Подвергшиеся трансцитозу вирусные частицы сохраняли способность заражать клетки, но эффективность транспорта вирусов сквозь клетки оставалась низкой. В настоящее время разрабатываются аденовирусные вектора, содержащие как сигнальные молекулы, направляющие вирусы на трансцитоз, так и молекулы, опосредующие связывание и заражение раковых клеток, находящихся «по ту сторону» стенки сосудов (33).

(Е) Мультифункциональные частицы на основе вирусных векторов

Концепция мультифункциональных частиц (МФЧ) на основе вирусных векторов возникла относительно недавно. Она направлена на то, чтобы терапевтические вирусные векторы осуществляли сразу несколько функций: адресную доставку генетического материала именно в раковые клетки, давали возможность их визуализации в организме и обладали бы прогрессирующим онколитическим действием. В качестве примера МФЧ на основе вирусного вектора можно привести ААВ с модифицированными белковыми «шипами», находящимися на оболочке вируса (с помощью шипов вирус взаимодействует с клеткой-мишенью). Изменения позволили одновременно «нацеливать» вирусы на раковые клетки и визуализировать передвижение, воспроизведение и распространение ААВ. Взаимодействие тимидин-киназы ТК ВПГ, находящейся на поверхности модифицированного ААВ, с известным субстратом для позитронной эмиссионной томографии (Positron Emission Tomography, PET) 18F-пенцикловиром (18F-penciclovir) позволяет проводить мониторинг вирусных частиц в клинической практике. Кроме этого, фермент ТК ВПГ открывает возможности для так называемой суицидной генотерапии, суть которой заключается в следующем: фермент ТК преобразует свои субстраты (такие лекарства, как ганцикловир) в метаболиты, узнаваемые ферментами зараженной клетки. Последовательное воздействие клеточных белков на эти метаболиты приводит к образованию токсичного конечного продукта, вызывающего гибель клетки (34). Интересно, что продукция ТК ВПГ инфицированной опухолевой клеткой индуцирует самоуничтожение смежных клеток, в чем проявляется одно из свойств МФЧ – прогрессирующее онколитическое действие.

Концепция МФЧ на основе вирусных векторов открывает широкие возможности применения нанотехнологий. Мониторинг вирусных частиц можно осуществлять с помощью наноразмерных меток, иммобилизованных на оболочках вирусов (35). Однако вопрос об адресной доставке вирусных МФЧ в клетки опухоли остается открытым.

Механизмы генотерапии с помощью вирусных векторов

(А) Коррекционное добавление гена

Все онкологические заболевания принято подразделять на p53-зависимые и p53-независимые, поскольку большинство случаев заболевания раком опосредовано мутациями в гене p53. Белок р53 представляет собой известный опухолевый супрессор, основная функция которого заключается в поддержании стабильности генома. Он принимает участие в регуляции клеточного цикла, в исправлении возникающих дефектов ДНК и в апаптозе – запрограммированной клеточной гибели . Воздействие на клетку факторов, вызывающих изменения в структуре ДНК, таких как ультрафиолетовое излучение, ионизирующая радиация и различные химические вещества, приводит к активации белка p53, который индуцирует либо арест клеточного цикла, необходимый для исправления возникших дефектов ДНК (репарацию), либо запускает механизм апоптоза. По этой причине мутации в гене p53 могут приводить к неконтролируемой клеточной пролиферации и к мутагенезу, опосредуя возникновение и прогрессию злокачественного новообразования.

Доклинические испытания показали, что замена мутантного гена p53 в раковых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии, приводит к полному восстановлению функций белка p53 и запускает апоптоз злокачественных клеток(36,37).

Клинические испытания ретровирусных и аденовирусных векторов, несущих неповрежденные гены p53, оказались эффективными в замене дефектных генов p53 у пациентов, страдающих немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ, non small cell lung cancer - NSCLC) и бронхоальвеолярной карциномой (38,39,40). К сожалению, в клинических испытаниях не удалось обнаружить значительного терапевтического эффекта даже при совместном применении аденовирусных векторов, рекомбинантных по гену p53 дикого типа, и химиотерапии (41).

(Б) Суицидная генотерапия

Суть суицидной генотерапии заключается в доставке в злокачественные клетки гена, кодирующего фермент, который конвертирует пролекарство в лекарство - «суицидный токсин», вызывающий гибель зараженных раковых клеток. Ярким примером суицидного фермента является тимидинкиназа (ТК) вируса простого герпеса (ВПГ) (herpes simplex virus - HSV). ТК ВПГ преобразует нетоксичные аналоги нуклеозидов, такие как ганцикловир или ацикловир, в токсичные вещества, приводящие к гибели клеток. Наподобие описанной выше методики аденовирусного переноса гена p53, доклинические испытания аденовирусного вектора AdHSV TK (adenoviral HSV TK), кодирующего ТК ВПГ, продемонстрировали гибель не только инфицированных, но и смежных с ними клеток при систематическом введении ганцикловира. Эффект объясняется как воздействием токсинов, высвобождаемых зараженными клетками, на соседние клетки, так и ответом иммунной системы на инфекцию (42).

_________________
с возврашением я рад всем